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荧光显微镜的应用

更新时间:2011-09-10点击次数:1962

 

荧光显微镜的应用
近二十年来,荧光显微镜在生物学和医学的许多领域内得到了广泛的应用,现在它已经成为一种重要的*的观察和侧试手段。一个非常重要而且广泛应用的技术是免疫荧光,当用抗原一抗休相互特异作用的荧光标记抗体进行处理时,就能够地对生物标本中的特异结构、特异组分进行定位。在许多研究领域内,比如细胞遗传学中的染色体分析、神经组织中的组织化学以及蛋白质和核酸的定位中,荧光显微镜已经变成一种重要的工具。当能够检测标本中荧光染料的很小含量时,就可以用它对组织和细胞中的一定的物质进行定位和定量,Rigler ( 1969)已经能够用这种方法确定在一个单细胞中10-36g的DNA含量。特别是当荧光显徽镜与细胞光度计结合起来制造出荧光显微光度计后,它变为一个非常灵敏而又方便的细胞化学测量仪器,可以地测定细胞中蛋白质、DNA, RNA等一些组分的含量。
    在荧光显微镜的使用中,应注意以下几个问题:
    (1)标本。用于荧光显微镜的标本不宜太厚,否则会消耗大部分激发光,而且物镜直接观察到的标本上部不能得到充分的激发。另外,太厚的标本往往因细胞重迭或杂质掩盖,会降低像的反差和清晰度。
    (2)载玻片。载玻片的厚度一般应在0.8-1.2mm之间,太厚的玻片不仅吸收较多的光能,而且不能使激发光在标本平面聚焦。玻片应光照均匀,无油迹,无划痕。否则,将会出现杂乱的非特异荧光,影响观察和判断。使用很薄的对紫外光有很好通透性的石英玻片。
    (3)盖玻片。所用盖玻片可以是一般的玻瑞,因为只有在可见光范围内的荧光对于像是重要的。为了加强激发光,用干涉盖玻片,它可以让荧光顺利通过,而反射激发光。被反射回来的激发光又可以再次激发标本。
    (4)封藏剂。封藏剂必须是无荧光、无颜色的,通常使用优级分析纯甘油盐水缓冲液(90%甘油,10%磷酸盐缓冲液,pH7.1-3.6 )。为了固定盖玻片,可用。.5%明胶,加到玻片以后以10%福尔马林固定,也可用淀粉青。另外,还可以使用水、甘油、阿拉伯树胶、糖浆和液体石蜡等。加拿大树胶具有荧光性,因而不能作封藏剂。
    (5)浸油。在普通显微镜中所用的香柏油是不能直接使用的,必须加入一定童的硝基苯(荧光熄灭剂)才勉强可用,但效果不好;纯植香油是比较好的浸油,另外液体石蜡和纯甘油(加10%磷酸盐缓冲液)是比较好的代用品,用起来也很方便。只是折光率较低,对像的质量略有影响。
    (6)固定液。不能用自身产生荧光或抑制荧光的物质作为固定液,福尔马林和酒精是比较安全的固定液,但不要使标本长时间浸入福尔马林中,石蜡也常常会发生荧光。
    (7)粘着剂。贴切片用的蛋白甘油粘着剂也会产生荧光,因而要以蒸馏水代替。较好的方法是冰冻切片,但荧光物质具有水溶性时有流出的危险。
(8)眼睛的保护。用明视野透射光观察荧光时,大部分紫外线就能直接通过目镜而伤害眼睛。为了防止紫外光,目镜上面可以装设保护镜(撼光镜),以吸攻紫外光。当用暗视野集光器进行荧光观察时,必须注意不要使物镜的数值孔径过大,否则,紫外光仍会进入眼睛。使用落射光照明装置是防止紫外线伤害作用的有效方法。

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